Aussäen der Prostata in vitro

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Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von biologischen Materialzusammensetzungen tierischen Ursprungs, insbesondere als Futter- oder Lebensmittel. Die Produktion von Biomasse als Futtermittel zur Ernährung von Tieren ist eine der wichtigsten Herausforderungen der modernen Tierwirtschaft. Die sog. Es besteht ein starkes Interesse an einer wachsenden Futter-und Lebensmittelproduktion auf der Grundlage tierischer Ausgangsmaterialien, um beispielsweise den Anforderungen des Bevölkerungswachstums und der Ernährung in Hungergebieten gerecht zu werden.

Weder eine erweiterte Tierproduktion noch ein verstärkter Fischfang liefern hierzu dauerhafte Lösungen. Die Aufgabe der Erfindung ist Aussäen der Prostata in vitro, verbesserte Verfahren zur Herstellung einer biologischen Materialzusammensetzung tierischen Ursprungs, insbesondere als Futter- oder Lebensmittel, bereitzustellen, mit denen die Probleme der herkömmlichen Futter- oder Lebensmittelproduktion überwunden werden und die insbesondere ermöglichen, Futter- oder Lebensmittel Aussäen der Prostata in vitro produzieren, die in ihrer Zusammensetzung und Verwertbarkeit den bisher gewonnenen Tierprodukten gleichwertig oder identisch sind.

Ein weiterer Gesichtspunkt der Aufgabe der Erfindung ist es, Aussäen der Prostata in vitro entsprechende biologische Materialzusammensetzung für Futter- Aussäen der Prostata in vitro Ernährungszwecke bereitzustellen, bei deren Produktion die Nachteile der herkömmlichen Tierproduktion vermieden werden, d.

Diese Aufgaben werden durch Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Die Zellverbände werden im Folgenden auch als organoide Körper bezeichnet. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens besteht in der kompletten Abkopplung der Biomasseproduktion von der herkömmlichen Tierproduktion, wobei dennoch der hergestellten Materialzusammensetzung in Abhängigkeit von dem tierischen Organismus, aus dem die Stammzellen isoliert wurden, und konkreten Aussäen der Prostata in vitro eine Aussäen der Prostata in vitro, strukturelle und insbesondere geschmackliche Eigenart aufgeprägt werden kann.

Die Erfinder haben festgestellt, dass die aus dem exokrinen Drüsengewebe isolierten adulten Stammzellen pluripotent sind und eine hohe Teilungsfähigkeit und ein starkes Wachstum zeigen. Die Biomasseproduktion erfolgt nicht auf natürlichem Weg durch das Wachstum des Tieres, sondern synthetisch insbesondere bei der Präparation der Materialzusammensetzung in so genannten in-vitro Laborkulturen.

Ramiya et al. Bei diesen Stammzellen handelt es sich jedoch nicht um pluripotente adulte Stammzellen, die zu Zellen aller drei Keimblätter differenzieren können. Der Begriff "adult", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadium des Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donororganismus, aus dem das Gewebe stammt.

In einer stark bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um acinäres Gewebe. Ganz besonders bevorzugt stammt das acinäre Gewebe aus dem Pankreas, der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse. Dies ist sowohl unter ethischen Gesichtspunkten als auch mit Blick auf die Möglichkeit der weiteren Beobachtung des Donortieres hinsichtlich eventueller Krankheiten von besonderem Vorteil.

Die Erfinder haben festgestellt, dass die aus den exokrinen Drüsen isolierten Stammzellen organoide Körper bilden, die bei Nährstoffversorgung ein starkes Wachstum zu Gewebekörpern mit Durchmessern von einigen Millimetern oder Aussäen der Prostata in vitro zeigen. Die Präparation der Materialzusammensetzung auf der Grundlage der Gewebekörper besitzt den Vorteil einer erhöhten Effektivität der Biomaterialproduktion.

Die organoiden Körper enthalten dabei keine Organe oder ein funktionsfähiges Nervensystem, sondern bestehen aus Gewebeschichten verschiedener Zellzusammensetzungen. Es können verschiedene Zelltypen kombiniert werden, die von verschiedenen Donortieren stammen, um bestimmte Nähr- oder Geschmackseigenschaften zu erzielen.

Wenn hingegen die Zellen im Komposit abgestorben sind und nicht weiter wachsen, können sich Vorteile für die weitere Bearbeitung der Materialzusammensetzung ergeben.

Erstens kann Aussäen der Prostata in vitro Zusammenwachsen der beteiligten organoiden Körper oder Gewebekörper zum Komposit vorgesehen sein, das dann vorteilhafterweise weiter wachsen kann.

Zweitens kann ein adhärentes Anhaften der beteiligten organoiden Körper oder Gewebekörper vorgesehen sein, wobei auch in diesem Fall ein weiteres Wachstum Aussäen der Prostata in vitro sein kann.

Durch ein Zusammenpressen der organoiden Körper oder Gewebekörper kann ein Verdichten des Formkörpers und damit eine bestimmte Struktur erzielt werden. Die Prägeeinrichtung kann z. Dadurch kann die Materialzusammensetzung mit einer gewünschten Konsistenz, wie z. Die Struktureinstellung kann bspw. Alternativ wird insbesondere, wenn die Gewebekörper elektrisch anregbare Muskelzellen enthalten, eine Struktureinstellung durch eine Einwirkung elektrischer Felder Aussäen der Prostata in vitro.

Das Komposit wird durch ein elektrisches Feld angeregt, so dass die Muskelzellen eine Struktur bilden, die der von Muskelfleisch Aussäen der Prostata in vitro ist. Besonders bevorzugt werden die organoiden Körper einer Differenzierung unterzogen, die zu wenigstens einem der folgenden Zelltypen führt, die Muskelzellen, Bindegewebszellen, Fettzellen und Enzym-produzierende Zellen umfassen.

In diesem Fall enthalten die organoiden Körper oder entsprechende Gewebekörper vorrangig den differenzierten Zelltyp. Die Differenzierung kann allgemein durch den Zusatz an sich bekannter Differenzierungsfaktoren erfolgen. Besonders bevorzugt erfolgt jedoch bei der Kultivierung der organoiden Körper oder dem Wachstum der Gewebekörper ein Zusatz von bereits differenzierten, insbesondere autologen Zellen, die die weitere Differenzierung im organoiden Körper Aussäen der Prostata in vitro Gewebekörper auslösen oder beeinflussen.

Wenn die biologische Materialzusammensetzung aus verschiedenen Gruppen organoider Körper oder Gewebekörper, die jeweils verschieden differenziert sind, präpariert wird, können sich Vorteile für die weitere Verwertung der Materialzusammensetzung, insbesondere in Bezug auf die Nährstoffzusammensetzung, die Struktur und den Geschmack ergeben.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. So kann bspw. Die im Folgenden erläuterten Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich beispielhaft auf die Erzeugung der biologischen Materialzusammensetzung aus Stammzellen, die Ratten oder Schweinen entnommen wurden.

Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Tierarten beschränkt. Vielmehr können die entsprechenden Verfahren an allen nicht-menschlichen Organismen mit differenzierten exokrinen Drüsen mit acinärem Gewebe realisiert werden, so z.

Entsprechend dem in Figur 2 dargestellten Schema wird zur Gewinnung der Zellen acinäres Gewebe - bevorzugt einer Speicheldrüse oder der Bauchspeicheldrüse Pankreas - mechanisch und enzymatisch zerkleinert in Kultur genommen Schritt 10 in Figur 2. Entgegen den Angaben von Bachem et al. Alle 2 bis 3 Tage wird das Medium gewechselt, wobei alle differenzierten Zellen entfernt werden.

Bei den in Kultur persistierenden Zellen handelt es sich um undifferenzierte Zellen mit uneingeschränkter Teilungsfähigkeit. Ähnliche Zellen sind unter gleichen Bedingungen aus dem Pankreas isoliert und beschrieben und als eine Art Myofibroblasten bzw. Im Gegensatz zu den Zellen der vorliegenden Erfindung konnte eine uneingeschränkte Teilungsfähigkeit jedoch nicht beobachtet werden. Weiterhin konnten diese Zellen auch nicht unbegrenzt passagiert werden, ohne an Vitalität zu verlieren.

Dazu werden die Tropfen auf Deckel von bakteriologischen Petrischalen gegeben, umgedreht und über die mit Medium gefüllte Petrischale gelegt, so dass die Tropfen nach unten hängen. Durch diese Art der Kultivierung bilden sich innerhalb von 48h die als organoide Körper bezeichneten Zellaggregate 14die für ungefähr 6 Tage in eine Suspensionskultur umgesetzt werden Die Teilansicht 18 Aussäen der Prostata in vitro Figur 2 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines solchen organoiden Körpers 2.

In Figur 3 sind die verschiedenen Möglichkeiten, organoide Körper als Ausgangsmaterialien für die weitere Präparation bereitzustellen, mit weiteren Einzelheiten zusammengestellt. Nach der oben beschriebenen Kultivierung der isolierten Stammzellen im hängenden Tropfen Schritt erfolgt die Aggregation zu den so genannten primären organoiden Körpern Schrittdie direkt der Differenzierung und dem Wachstum Schritt in Figur 1 unterzogen werden können.

Alternativ erfolgt zunächst die Ablage der primären organoiden Körper auf einem Substrat zur Schaffung einer Adhäsionskultur siehe auch Figur 4. Die Erfinder haben Aussäen der Prostata in vitro, dass die in Suspensionskultur wachsenden primären organoiden Körper in Adhäsionskultur neue organoide Körper bilden können.

Auf dem Substrat folgt durch eine Zellwanderung die Bildung einer Monoschicht Schritt und aus dieser die Aggregation zu den so genannten sekundären organoiden Körpern Schritt Die Bildung der sekundären organoiden Körper ist auch in Figur 4 illustriert.

Die primären organoiden Körper 2 bilden auf dem Substrat der Adhäsionskultur, wie z. Mit der Kultivierung der primären organoiden Körper 2 zu sekundären organoiden Körpern 4 wird eine weitere Vervielfältigung des Biomaterials geschaffen. Aus jedem der primären oder sekundären organoiden Körper 2, 4 können bei weiterer Kultivierung Gewebekörper wachsen. In den folgenden, nicht-beschränkenden Beispielen wird die Isolierung und Aggregation von Stammzellen näher erläutert.

Die allgemeinen Arbeitsanweisungen, wie sie für Verfahren zur Kultivierung von tierischen Zellen und insbesondere von Säugetierzellen gebräuchlich sind, sind zu beachten. Eine sterile Umgebung, in der das Verfahren durchgeführt werden soll, ist - auch wenn hierzu keine weitere Beschreibung erfolgt - in jedem Fall einzuhalten.

Statt fötalem Kalbserum FKS im Nährmedium und Differenzierungsmedium kann gegebenenfalls auch Eigenplasma oder, Aussäen der Prostata in vitro bevorzugt, Eigenserum des Gewebedonors verwendet werden.

Das Nährmedium kann als Basismedium statt des verwendeten DMEM-Mediums auch ein anderes für die Kultivierung von eukaryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, bekanntes, geeignetes Basismedium enthalten, in dem die differenzierten Zellen absterben und sich die gewünschten Stammzellen vermehren.

Auch Isolationsmedium, Inkubationsmedium und Differenzierungsmedium können ein anderes Aussäen der Prostata in vitro und geeignetes Basismedium enthalten. Die folgenden Beispiele 1 und 2 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokolle zur Isolierung und Kultivierung adulter pluripotenter Stammzellen aus acinärem Gewebe des Pankreas.

Beispiel 3 beschreibt ein entsprechendes Protokoll für die Isolierung aus acinärem Gewebe der Speicheldrüse.

In den Ductus pancreaticus von Jahre alten Ratten werden mittels einer Spritze und einer stumpfen Kanüle bei der Ratte 10 ml Digestionsmedium langsam und luftblasenfrei injiziert.

Das gesamte Pankreas wird dadurch aufgeblasen und kann so besser herauspräpariert werden. Das Pankreas wird dann in ein Becherglas Aussäen der Prostata in vitro und weitere 5 ml Digestionsmedium dazugegeben. Danach saugt man das Medium vorsichtig ab, zerkleinert erneut mit einer Schere das Gewebe und wäscht die Gewebestücke zweimal mit je 10 ml Isolationsmedium und gibt Aussäen der Prostata in vitro 5 ml Digestionsmedium zum Gewebe hinzu.

Das zuletzt erhaltene Pellet wird in Inkubationsmedium resuspendiert, begast und auf Gewebekulturschalen verteilt. Alle Tage wird das Medium gewechselt. Dabei werden alle differenzierten Zellen entfernt. Dabei lösen sich die Zellen vom Boden der Aussäen der Prostata in vitro. Die Zellsuspension wird 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.

Der Medienwechsel erfolgt alle drei Tage. Die Zellsuspension wird 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Aussäen der Prostata in vitro in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben. Die Zellen werden weiter kultiviert und so oft passagiert Aussäen der Prostata in vitro ausgesät, bis die Zellen einen semikonfluenten bis konfluenten Zustand erreichen.

Pankreas-Acini wurden von männlichen Sprague-Dawley-Ratten g erhalten, die narkotisiert CO 2 und über die dorsale Aorta ausgeblutet worden waren. Nach Minuten wurde das oben schwimmende Fett und das Medium abgesaugt und das Gewebe wurde erneut zerkleinert und mit Medium ohne Kollagenase gespült Vorgang mindestens zweimal wiederholen, vorzugsweise solange bis Zellfraktion transparentworauf Digestionsmedium zugegeben und erneut etwa 1 Minute lang mit Carbogen begast wurde.

Rinderserumalbumin, mit Carbogen äquilibriert und auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur Zentrifugation, Absaugen, Resuspension wurde fünfmal wiederholt. Das acinäre Gewebe starb dabei schnell innerhalb von zwei Tragen ab und die sterbenden differenzierten Zellen lösten sich dabei von den benachbarten Zellen, ohne diese zu schädigen schonende Isolierungdie nicht absterbenden Stammzellen sanken zu Boden und hefteten sich an. Die differenzierten Acinizellen sind dazu nicht in der Lage.

Zu diesem Zeitpunkt hatten sich die ersten Stammzellen bzw. Der Mediumwechsel wurde danach an jedem dritten Tag wiederholt und differenzierte Aussäen der Prostata in vitro Pankreaszellen wurden bei jedem Mediumwechsel entfernt. Die Zellsuspension wurde 5 Minuten bei etwa UpM Beckmann GPR-Zentrifuge zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.

Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei UpM zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.

Am Aussäen der Prostata in vitro 17 erfolgte ein drittes Passagieren auf insgesamt 6 mittlere Zellkulturflaschen und am Tag 24 ein viertes Passagieren auf insgesamt 12 mittlere Zellkulturflaschen.

Spätestens jetzt waren alle primären Zellen bis auf die Stammzellen aus der Zellkultur entfernt. Die Stammzellen können weiter kultiviert werden und so oft passagiert und ausgesät wie gewünscht.

Die Isolierung und Kultivierung aus exokrinem Gewebe der Ohrspeicheldrüse erfolgte analog dem Pankreas-Protokoll mit den folgenden Abweichungen: 1. Im konkreten Beispielsfall betrug die Aufbewahrungszeit 15 h und brachte keine nachteiligen Folgen für die Isolierung der gewünschten Stammzellen mit sich. Die folgenden Beispiele 4 und 5 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokolle zur Herstellung von organoiden Körpern und differenzierten Zellen.

Die undifferenzierten Zellen werden mit einer Lösung aus 10 ml PBS, 4 ml Trypsin, 8 ml Differenzierungsmedium abtrypsiniert und 5 Minuten abzentrifugiert. Mit Hilfe einer automatischen Pipette werden auf einen Deckel ca.