Diffuse Heterogenität der Prostata

Prostatabeschwerden // Prostata, Prostatakrankheiten, Harndrang,

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Gebiet der Erfindung. Die vorliegende Diffuse Heterogenität der Prostata betrifft allgemein die Gebiete der Zellbiologie und der Diagnose neoplastischer Erkrankungen.

Extrazelluläre Proteasen hängen direkt mit dem Tumorwachstum, der Ablösung von Tumorzellen bzw. Migration von Tumorzellen und der Invasion von Zielorganen zusammen. Einzelne Klassen von Proteasen sind 1 an dem Abbau des den anfänglichen Tumorbereich umgebenden Stromas, 2 am Abbau der Zelladhäsionsmoleküle, was die Dissoziation von Tumorzellen erlaubt, und 3 an der Invasion der Basismembran beim metastatischen Wachstum und der Aktivierung von sowohl Tumorwachstumsfaktoren als auch angiogenen Faktoren sowie anderen Vorgängen beteiligt.

Der Stand der Technik ist dahingehend unzureichend, dass wirksame Screeningtechniken zur Identifizierung von Proteasen, die beim Karzinom überexprimiert werden, fehlen.

Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen im Fachgebiet seit langem bestehenden Bedarf. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Screeningsystem zur Identifizierung von bei Karzinomen überexprimierten Proteasen durch Untersuchung von PCR-Produkten, die aus Tumoren im frühen Stadium, metastatischen Tumoren und normalem Ovarienepithel amplifiziert werden. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der zur Expression der DNA der vorliegenden Erfindung befähigt, zur Expression in einer rekombinanten Zellen angepasst ist und für die Expression der DNA in der Zelle erforderliche Regulationselemente umfasst.

Andere und weitere Gesichtspunkte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zum Zwecke der Offenbarung angegeben sind, ersichtlich.

Damit der Gegenstand, in welchem die vorstehend genannten Merkmale, Vorteile und Ziele der Erfindung sowie andere, die ersichtlich werden, enthalten sind, bereitgestellt und im Einzelnen verstanden werden kann, werden genauere Beschreibungen der vorstehend kurz zusammengefassten Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht werden, bereitgestellt.

Diese Zeichnungen bilden einen Teil der Spezifikation. Es wird jedoch darauf aufmerksam gemacht, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen und daher nicht als den Schutzbereich einschränkend anzusehen sind.

Die kritischen Reste der katalytischen Triade sind durch gelbe Schattierung angezeigt, während eine potentielle Glycosylierungsstelle durch violette Schattierung markiert ist. U verglichen. Diffuse Heterogenität der Prostata mindestens drei der fünf Sequenzen identische Aminosäurereste sind grün schattiert. Gelb schattierte Reste stellen Aminosäuren dar, die bei mindestens drei Sequenzen ähnlich sind. Die Positionen der Reste der katalytischen Triade sind markiert.

Einzelne Fälle sind in einer Punktwolke dargestellt. Es wurden polyklonale Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen mit einem von drei mit Polylysin verknüpften Mehrfachantigenpeptiden, die anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz von TADG14 erzeugt wurden, hergestellt. Der Blot wurde gewaschen und mit einem Chemilumineszenzsubstrat Bio-Rad inkubiert, bevor er für diffuse Heterogenität der Prostata Sekunden zur Visualisierung auf einen Röntgenfilm aufgelegt wurde.

Bei normalen Ovarien wurde keine Färbung beobachtet. Das in der Teilfigur F gefärbte klare Zellkarzinom zeigt eine diffuse Färbung über sämtliche Tumorzellen. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig beschrieben. Glover Hrsg. Gait Hrsg. Higgins Hrsg. Freshney, Hrsg. Falls vorliegend verwendet, diffuse Heterogenität der Prostata daher die folgenden Ausdrücke diffuse Heterogenität der Prostata nachstehend angegeben definiert. NH 2 bezieht sich auf die am Aminoterminus eines Polypeptids befindliche Aminogruppe.

Diffuse Heterogenität der Prostata wird darauf hingewiesen, dass sämtliche Aminosäurerestsequenzen vorliegend durch Formeln dargestellt werden, deren Schreibweise von Links nach Rechts in der üblichen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus vorliegt. Des Weiteren wird darauf hingewiesen, dass ein Bindestrich am Anfang oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz mit einer oder mehreren Aminosäureresten anzeigt.

Die vorstehende Tabelle ist dargestellt, um die Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen diffuse Heterogenität der Prostata, die vorliegend abwechselnd erscheinen können. RestriktionsfragmentenViren, Plasmiden und Chromosomen zu finden ist, ein. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'- Amino- Terminus und ein Translationsstoppcodon am 3'- Carboxyl- Terminus bestimmt.

Ein Polyadenylierungssignal diffuse Heterogenität der Prostata eine Transkriptionsterminationssequenz befindet sich üblicherweise in 3' zur codierenden Sequenz. Verstärker, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und ähnliche, welche die Expression einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle gewährleisten.

Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt, und sie erstreckt sich stromaufwärts in 5'-Richtung über die minimale Anzahl von Basen oder Elementen, die zur Initiation von Transkriptionsspiegeln, die über den Hintergrund detektierbar sind, erforderlich sind.

Innerhalb der Promotorsequenz sind eine Transkriptionsinitiationsstelle sowie Proteinbindungsdomänen Konsensussequenzen vorhanden, die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen zusätzlich zu den und Konsensussequenzen. Diese Sequenz codiert, N-terminal zum Polypeptid, ein Signalpeptid, welches der Wirtszelle mitteilt, dass das Polypeptid zur Zelloberfläche dirigiert wird oder das Polypeptid in das Medium sezerniert wird, und dieses Signalpeptid wird von der Wirtszelle abgespalten, bevor das Protein die Zelle verlässt.

Signalsequenzen können mit verschiedenen prokaryotischen oder eukaryotischen Proteinen assoziiert vorliegen. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des erwünschten Extensionsprodukts in Gegenwart des induzierenden Diffuse Heterogenität der Prostata zu starten. Beispielsweise enthält der Oligonukleotidprimer bei diagnos tischen Anwendungen in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide enthalten kann.

Dies bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Daher braucht die Primersequenz nicht die exakte Sequenz der Matrize widerzuspiegeln. Beispielsweise kann ein nichtkomplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angefügt werden, wobei der Rest der Primersequenz zu dem Strang komplementär ist. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle integriert damit kovalent verknüpft werden oder auch nicht.

Bei eukaryotischen Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine solche, in welcher die transformierende DNA in ein Chromosom integriert wurde, so dass sie an die Tochterzellen durch die Chromosomenreplikation diffuse Heterogenität der Prostata wird.

Diese Stabilität wird durch die Befähigung der eukaryotischen Zellen zur Erzeugung von Zelllinien oder Klonen, die eine Population von Tochterzellen enthalten, welche die transformierende DNA aufweisen, demonstriert. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch Vergleich der Sequenzen unter Verwendung von in Sequenzdatenbanken erhältlicher Standardsoft ware oder in einem Sothern-Hybridisierungsexperiment unter beispielsweise stringenten Diffuse Heterogenität der Prostata, wie sie für das jeweilige System definiert sind, identifiziert werden.

Diffuse Heterogenität der Prostata Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist einem Fachmann bekannt. Siehe beispielsweise Maniatis et al. In einem anderen Beispiel ist die codierende Sequenz ein Konstrukt, in welchem die codierende Sequenz selbst in der Natur nicht vorkommt z. Allelvariationen oder natürlicherweise auftretende Mutationsereignisse ergeben keine wie vorliegend definierte heterologe DNA-Region. Die üblicherweise für diese Untersuchungen verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, und andere.

Es sind eine Anzahl von fluoreszierenden Stoffen bekannt und können als Markierungen verwendet werden. Ein bestimmtes Detektionsmaterial ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen hergestellt wird, und mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugiert ist.

Proteine können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann durch beliebige der derzeit verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Enzymmarkierungen sind in ähnlicher Weise geeignet und können durch beliebige der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden.

Das Enzym ist mit dem ausgewählten Partikel bzw. Teilchen diffuse Heterogenität der Prostata Reaktion mit Verbrückungsmolekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und ähnlichen konjugiert.

Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können eingesetzt werden. Es wird beispielhaft auf die U. Ein bestimmtes Testsystem, das im Fachgebiet entwickelt diffuse Heterogenität der Prostata verwendet wurde, ist als Rezeptortest bekannt. Auf diese Weise können Unterschiede in den Affinitäten zwischen den Materialien festgestellt werden.

Falls es beispielsweise erwünscht ist, eine Verbindung als Ligand eines bestimmten Rezeptors zu bewerten, wäre eines der Plasmide ein Konstrukt, das in der Expression des Rezeptors in der gewählten Zelllinie resultiert, während das zweite Plasmid das Luciferasegen verknüpft mit diffuse Heterogenität der Prostata Promotor aufweisen würde, in welches das Reaktionselement auf den jeweiligen Rezeptor eingefügt ist.

Diffuse Heterogenität der Prostata die zu testende Verbindung ein Agonist des Rezeptors ist, bildet der Ligand einen Komplex mit dem Rezeptor, und der resultierende Komplex bindet das Reaktionselement und initiiert die Transkription des Luciferasegens. Dann wird die resultierende Chemilumineszenz photometrisch gemessen, und es werden Dosis-Antwort-Kurven erhalten und mit denjenigen von bekannten Liganden verglichen. Das vorstehende Protokoll wird im Einzelnen im U.

Für die Zwecke der prokaryotischen Transformation ist die Verwendung eine Vektors, diffuse Heterogenität der Prostata die codierenden Sequenzen für das Gen, welches ein humanes TAGDProtein der vorliegenden Erfindung codiert, enthält, besonders bevorzugt.

Prokaryotische Wirte können E. Diffuse Heterogenität der Prostata Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, welche die wirksame Transkription des eingefügten DNA-Fragments erleichtern, zusammen mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen oder mehrere Diffuse Heterogenität der Prostata enein oder mehrere Terminator en sowie spezifische Gene, die zur Bereitstellung einer phänotypischen Selektion in transformierten Zellen befähigt sind.

Die Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine unmittelbare Funktion der Anzahl von übereinstimmenden oder identischen Positionen. Wenn eine Unterposition in beiden der zwei Sequenzen von der gleichen monomeren Untereinheit besetzt wird, z.

Die Länge von Vergleichssequenzen beträgt im Allgemeinen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 60 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens 75 Nukleotide und am meisten bevorzugt Nukleotide. Die Sequenzidentität wird typischerweise unter Verwen dung einer Sequenzanalyse-Software z. Ein Expressionsvektor ist ein replizierbares Konstrukt, in welchem eine ein Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in funktionsfähiger Weise mit geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft ist, die zur Diffuse Heterogenität der Prostata der Expression des Polypeptids in einer Zelle befähigt sind.

Der Bedarf nach derartigen Kontrollsequenzen hängt von der gewählten Zelle und dem ausgewählten Transformationsverfahren ab. Es können einem Fachmann diffuse Heterogenität der Prostata Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die geeignete transkriptionelle und translationelle Kontrollsignale enthalten, verwendet werden. Siehe beispielsweise die in Sambrook et al. Typischerweise ist das Protein im Wesentlichen rein, wenn es zu mindestens 60 Gew.

Die Reinheit kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, z. Ein Protein ist im Wesentlichen frei von natürlicherweise damit assoziierten Komponenten, wenn es von mindestens einigen dieser Verunreinigungen, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten, getrennt ist.

Bindung an einen für TADG spezifischen Antikörper kann durch vorliegend beschriebene Verfahren festgestellt werden. Es werden Standardprotokolle zur Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper, die einem Fachmann bekannt sind, verwendet.

In einer Ausführungsform kann der Antikörper oder ein Fragment davon mit einem Toxin oder mit einer detektierbaren Markierung, z. Es gibt viele Beispiele von Elementen, die für die magnetische Resonanzbildgebung geeignet sind. Hinsichtlich Diskussionen der magnetischen In-vivo-Resonanzbildgebung siehe beispielsweise Schaefer et al. NMR 16,Wesbey et al.

NMR 16,Runge et al. Die Bindung dieser Markierungen an Antikörper oder Fragmenten davon kann unter Verwendung von Standardtechniken, die einem Fachmann bekannt sind, erreicht werden. Typische Techniken sind von Kennedy et al. Acta 70,und von Schurs et al. Acta 81,beschrieben. In Letzterem erwähnte Kopplungstechniken sind das Glutaraldehydverfahren, das Periodatverfahren, das Dimaleinimidverfahren, das m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren.

Wie vorliegend beschrieben, stellt die Erfindung eine Anzahl diagnostischer Vorteile und Verwendungen bereit.